Традиційна фотобіологія з використанням звичайних (теплових) джерел світла досить успішно розвивалася протягом багатьох років (є свідчення про те, що ще в Древньому Єгипті й Індії тисяча років тому застосовувалася фототерапія за допомогою сонячного світла і лікарських препаратів, виготовлених із фруктів і рослин) із виходом у практичну фотомедицину за трьома головними напрямками: діагностика, терапія і хірургія. Багато чого було зроблено для розуміння процесів фотосинтезу рослин і бактерій, з’ясовування природи зору, фотоперіодичних явищ і ін. за допомогою цих джерел світла. Поява принципово нового інструмента – лазера – підняло всі ці дослідження на новий, більш високий рівень, стимулювало постановку й успішне вирішення таких проблем, що раніш або зовсім не ставилися, або вирішувалися непрямим шляхом.
Розглянемо властивості лазерного випромінювання і їх принципові відмінності від властивостей випромінювання теплових некогерентних джерел світла (ламп розжарювання, дугових ламп, Сонця й ін.).
Лазер – це генератор оптичних коливань, що використовує енергію атомів, що випромінюють, або молекул у середовищах із інверсною заселеністю рівнів енергії, що мають властивість посилювати світло визначених довжин хвиль. Як зворотній зв’язок у лазерах використовують дзеркала, що утворюють оптичний резонатор і забезпечують достатнє число проходів світлового пучка через посилювальне середовище, щоб усі втрати світла в системі були компенсовані за рахунок посилення активного середовища. На рис.2.3 схематично показано структурну схему лазера, що містить дзеркала, які відбивають, і активний елемент, у якому за рахунок різноманітних засобів накачування створюється активне середовище. При зазначених умовах у лазері виникає генерація, спектр якої показаний на рис. 2.4, тобто лазер випромінює декілька хвиль, що відрізняються частотою й інтенсивністю, це так звані подовжні моди лазера.
Рисунок 1.3 – Структурна схема лазера (справа показано розподілення інтенсивності в лазерному пучку)
Звичайне (теплове) джерело світла відрізняється від лазера тим, що основний внесок у випромінювання дають спонтанні переходи, у системі відсутні інверсія й оптичний зворотній зв’язок. Все це призводить до істотних розходжень у властивостях лазерних і нелазерних джерел світла. Лазерні джерела мають високий ступінь монохроматичності (часової когерентності), просторової когерентності, спрямованості, поляризованості, інтенсивності і яскравості, надкороткої тривалості імпульсів і перенастроювань довжини хвилі випромінювання.
Рисунок 1.4 – Спектр подовжніх мод лазера
Монохроматичність або висока спектральна щільність потужності (інтенсивності) випромінювання, або значна часова когерентність лазерного випромінювання забезпечують, по-перше, проведення спектрального аналізу з дозволом, що на багато порядків перевищує дозвіл традиційних спектрометрів; по-друге, високий ступінь селективності порушення визначеного сорту молекул у їх суміші, що дуже важливо саме в біології; по-третє, дозволяють реалізовувати голографічні і інтерферометричні методи діагностики біооб’єктів.
Ступінь монохроматичності одномодового газового лазера визначається шириною лінії генерації dn цієї моди, що обумовлена квантовими флуктуаціями, вібраціями, акустичними шумами, коливаннями плазми в активному середовищі і т.д., і складає розмір від десятків герц до десятків мегагерц.
Висока монохроматичність визначає значну спектральну щільність випромінювання. Наприклад, для лазера з вихідною потужністю Р=1 Вт, dn=l МГц, радіусом пучка w=2 мм і l=500 нм спектральна щільність потужності, що падає на одиницю поверхні, дорівнює 2,6×107 Вт/(нм×см2). Для порівняння, аналогічна величина для сонячного випромінювання дорівнює 1,3×10-4 Вт/(нм×см2) [3].
У залежності від типу завдань і конкретних умов вимірювання для лазерів, що працюють на багатьох модах, можна забезпечити різноманітний ступінь монохроматичності. З одного боку, окрема мода практично зберігає свою високу монохроматичність (вузьку ширину лінії dn), а з іншого боку – мод стає багато і їх спектр займає вже ширину n»N×c/2×n×L де N – число подовжніх мод, c/2×n×L – частотна відстань між ними, обумовлена оптичною довжиною резонатора, с- швидкість світла, n – показник заломлення активного середовища (рис. 2.4).
Зміни в ступені монохроматичності знаходять висвітлення і в часовій когерентності такого джерела, тобто його спроможності утворювати чітку інтерференційну картину при відповідній часовій затримці світлових пучків, що додаються. Зручно часову когерентність характеризувати довжиною когерентності:
(2.1)
Для одномодових лазерів довжина когерентності може бути надзвичайно великою – 3×108-3×102 см.
У багатомодових лазерів із безупинним накачуванням ступінь когерентності в залежності від відстані носить осцилювальний характер: спочатку вона падає від одиниці до нуля на довжині lk»c/Dn (Dn=N×c/2×n×L), а потім знову відновляється на довжині, що дорівнює двом, чотирьом і т.д. довжинам резонатора. Повна втрата когерентності відбудеться лише на довжині c/dn.
Теплові джерела, наприклад натрієва лампа, мають час когерентності tk»10-10 із, тобто lk=3 см. Лазери із субнаносекундною тривалістю імпульсів або із шириною смуги генерації в декілька гігагерц мають таку ж малу довжину когерентності.
Просторова когерентність випромінювання лазерів дає можливість отримувати світлові пучки з високим ступенем їх спрямованості (колімованості) і дозволяє фокусувати їх на об’єкті до надзвичайно малих розмірів. Все це необхідно для дистанційного аналізу досліджуваних об’єктів, забезпечення локальності досліджень і ефективного транспортування випромінювання по волоконних світловодах, що теплові джерела в принципі забезпечити не можуть.
Лазери, як правило, випромінюють просторово-когерентні гаусові пучки (TEMooq моди), інтенсивність яких
(2.2)
Тут I0(z) – інтенсивність у центрі пучка (r=0); w(z) – радіус пучка лазера, на якому I(z)=I0(z)ехр(-2). Характерний вид розподілення показаний на рис.1.3 справа. Кут розбіжності гаусівського пучка дорівнює [13]:
q=l/pw(0), (2.3)
де w(0) – радіус пучка в найбільш вузькій його частині, z=0. Параметри w(0) і q задаються в основному параметрами резонатора. При достатньому відаленні від лазера w(z)=lz/pw(0)=zq.
Лазерні пучки в режимі поперечної моди найннижчого порядку (TEMooq) характеризуються надзвичайно високою просторовою когерентністю, близькою до граничної, обумовленою квантовими флуктуаціями. І тільки домішка поперечних мод вищих порядків може істотно її зменшити [3].
Для більшості лазерів розбіжність складає декілька тисячних радіана (мрад). Такий пучок можна сфокусувати до дуже малих розмірів порядку довжини хвилі: d=F×q (F – фокусна відстань лінзи) із глибиною різкості D=±d2/l) також порядку l. Ці властивості лежать в основі лазерної мікроскопії.
Відзначимо, що в ряді біологічних додатків сфокусований «робочий пучок» може виявитися істотно менше розмірів довжини хвилі і складати біля 0,01 мкм, оскільки дія світлового випромінювання в залежності від інтенсивності носить граничний характер, а інтенсивність у центрі пучка максимальна. Таким способом можна, наприклад, проводити тонку внутрішньоклітинну «хірургію».
Роль розбіжності випромінювання можна також уявити собі, якщо порівняти інтенсивності випромінювання, отримані від теплового і лазерного джерел однакової потужності Р, розташованы на відстані z від біооб’єкта:
IT = Р/4pz2, IЛ»Р/pw2 = Р/pz2q2.
Отже, IЛ/IТ » 4/q2, а оскільки розбіжність q»10-3, то ІЛ»106×ІТ.
Лазери характеризуються високим ступенем поляризованості випромінювання. У цьому виявляються когерентні властивості їх випромінювання. Проте вид поляризації (лінійна, кругова, еліптична) у різних лазерів може бути різним. У більшості випадків це пов’язано з властивостями оптичного резонатора. Резонатори з брюстерівськими віконцями розрядної трубки або внутрішніх призм мають стійку лінійну поляризацію. Для промислових лазерів із лінійною поляризацією ступінь поляризованості, тобто відношення інтенсивностей світла при взаємно ортогональних положеннях поляризаційного аналізатора, I|| : I^ =500 : 1. При цьому для лазерів із малим посиленням квантові і технічні флуктуації практично не призводять до деполяризації випромінювання [3,42].
Інший клас часто використовуваних резонаторів лазерів – це ізотропні резонатори. Наприклад, промисловість випускає лазери з внутрішніми дзеркалами. Висока якість дзеркал таких лазерів забезпечує ідеальну кругову поляризацію випромінювання, Іçç: І^ =1:1. Проте ступінь поляризації (азимут і еліптичність) у цих лазерів виявляється більш чутливим до збуджень, ніж у випадку сильно анізотропних резонаторів [42].
Передача лазерного випромінювання по волоконних світловодах круглого перерізу призводить до деполяризації випромінювання за рахунок збудження багатьох хвилеводних мод. У залежності від типу світловоду довжина, на якій відбувається повна деполяризація випромінювання, змінюється від декількох десятків сантиметрів до декількох метрів. Порівняно широкі медичні світловоди з діаметром серцевини 400-1000 мкм мають малу довжину деполяризації (декілька десятків сантиметрів). Розроблено спеціальні одномодові анізотропні світловоди (наприклад, з еліптичним перерізом серцевини), що зберігають стан поляризації на відстанях у декілька сотень метрів, проте поперечні розміри серцевини таких світлоходів надзвичайно малі, 5-7 мкм, тому існує проблема введення випромінювання.
Надзвичайно висока інтенсивність лазерного випромінювання дозволяє сконцентрувати в малому об’ємі значну світлову енергію, тим самим викликати багатофотонні й інші нелінійні процеси в біологічному середовищі, локальне теплове нагрівання, швидке випаровування, гідродинамічний вибух і т.і.
З погляду застосувань, не інтенсивність, а яскравість є найбільш важливим параметром будь-якого джерела, у тому числі і лазерного. Яскравість В визначається як потужність, що припадає на одиницю площі й одиницю тілесного кута, або інтенсивність в одиниці тілесного кута. Для пучка кругового перерізу радіусом w(0), розбіжністю q і повною потужністю Р, яскравість
В=P/p2w2(0)q2,
або з урахуванням (1.3) для лазерних пучків B=Р/l2 Вт/(см2×ср), де ср – стерадіан – одиниця тілесного кута.
Інтенсивність, яку можна одержати у фокусі лінзи, виявляється тим більшою, чим більша яскравість пучка. Оптична обробка пучка за допомогою системи лінз і інших оптичних елементів, як правило, не може збільшити яскравість, оскільки стиск пучка завжди супроводжується збільшенням його розбіжності.
Спектральна яскравість Bn=В/Dn або Bl=B/Dl, де Dn або Dl – ширина лінії джерела в герцах або нанометрах, Dn=(c/l2)Dl.
Однією із надзвичайних властивостей лазерів і лазерного випромінювання є можливість одержання імпульсів пікосекундної і субпікосекундної тривалості. Все це дає можливість вивчати дуже швидкі первинні фотопроцеси в біології прямими, а не непрямими методами, а також багатоступенево збуджувати високі енергетичні стани молекул за час значно менший, ніж час релаксації будь-якого проміжного стану.
Властивість перелаштування довжини хвилі лазерного випромінювання в сукупності з його надзвичайною монохроматичністю дозволяє використовувати лазери в якості спектрометрів ультрависокої роздільності. Взагалі, будь-який лазер допускає перенастроювання частоти (довжини хвилі). Правда, для одних лазерів вона може бути тільки дискретною з дуже вузьким діапазоном поблизу дискретних довжин хвиль, а для інших безперервною в досить широкому діапазоні довжин хвиль. Наявність лазерів, що перенастроюються у всій області від УФ до ІЧ дозволяє селективно збуджувати практично будь-які стани біомолекул і окремих її фрагментів [3].
Обговорюючи властивості лазерного випромінювання, не можна не звернути увагу на одну важливу для застосування властивість – спроможність формувати спекл-картину при відбитті від шорсткуватої поверхні. Розсіяне цією поверхнею світло складається з хаотичного скупчення темних і світлих плям (спеклів). Причина цього явища полягає у високій когерентності лазерного випромінювання, і воно обумовлено складною інтерференцією повторних хвиль від невеличких розсіювальних центрів, розташованих на поверхні об’єкта. Оскільки біооб’єкти здебільшого шорсткуваті, то вони завжди повинні формувати спекл-картину й у цьому смислі вносити деякі перекручування в результати досліджень. З іншого боку, спекл-поле несе інформацію про властивості поверхні біооб’єкта, що можна використовувати, наприклад, у діагностичних цілях [3].
Якщо спекл-картина спостерігається на достатньо віддаленому від об’єкта екрані, то середній діаметр зерна (спекла) визначається співвідношенням d»ll/w, де l – відстань від об’єкта до екрана, w – радіус лазерного пучка на об’єкті [13].