Визначення генетичної статі iндивiдуума за даними цитологiчного дослiдження

а)буккальний тест.

б)основнi цитогенетичнi методи визначення статi та аномалiй статевих хромосом.

в) використання Т – променів (ТГц випромінювання) для визначення генетичної статі та аномалій статевих хромосом.

Анотація. Робота присвячена новим методам визначення генетичної

статі індивідуума за даними цитологічного дослідження за допомогою Т – променів.

Аннотация. Работа посвящена новым методам определения генетического пола индивидуума за данными цитологического исследования при помощи Т – лучей.

Annotation. Work is devoted to new methods of determination of sex of individuals after data of cytological research through T – rays.

Визначення клiтин слизової оболонки порожнини рота — так званий буккальний тест (вiд лат.”bucca” – щока) — являється простим неiнвазiйним методом визначення генетичної статi. Вiн оснований на виявленнi в ядрах епiтелiоцитiв тiльця Барра — скупчення гетерохроматину, вiдповiдаючого спецiалiзованiй та функцiонально неактивнiй однiєї з двох Х — хромосом у жiнок. Тiльце Барра в ядрах епiтелiальних клiтин слизової оболонки порожнини рота має вид щiльної гранули дiаметром менше 1 мкм, яка розташована безпосередньо пiд ядерною оболонкою.

Рисунок 1. Тiльце Барра (показано лівою стрiлкою) в ядрi епiтелiальної клiтини слизової оболонки порожнини рота на цитологiчному мазку. Ядро клiтини справа (рис.1,б) не мiстить тiльце Барра. Темна стрiлка — ядришко.

Для пiдвищення надiйностi тестування , крiм тiльця Барра , проводиться iдентифiкацiя Y — хромосоми шляхом зафарбовування хiнакрином. Виявлення проводиться за допомогою спецiальної установки представленої на рис.13., як i визначення тiльця Барра.

Обробка результатiв:

Стать iндивiдуума визначасться як жiночий у випадку позитивного результату першого тесту(визначення тiльця Барра) та негативного другого (визначення Y- хромосоми ), а чоловiча стать — як протилежнi результати.

Таблиця № 1, iдентифiкацiя результатiв.

Стать	Тільце Барра	Y – хромосома
Чоловіча	–	+
Жіноча	+	–

Найбiльш пiдходящою фазою для вивчення хромосом являється метафаза метозу. Для цього найчастіше використовують препарати короткотривалої культури крові, яму отримують через 48-72 години пiсля взяття кровi, але можуть використанi клiтини кiсткового мозку та , як в нашому випадку, культури фiбробластiв (епiтелiальнi клiтини ротової порожнини — буккальний тест).

При приготуваннi препаратiв хромосом до культури клiтин додають колхiцин, який руйнує веретено дiлення та зупиняє дiлення клiтини в метафазi. Потiм клiтини оброблюють гiпотонiчним розчином , пiсля чого їх фiксують та зафарбовують. Далi такi клiтини, за допомогою свiтла проходять аналiз.

Рисунок 2. Хромосома в метафазi метозу.

1 — хроматида; 2— центромера ; 3 — коротке пличе q; 4- довге пличе р.

Опис методiв.

На сьогоднi iснують такi основнi цитогенетичнi методи:

• стандартнi цитогенетични методи

• високочутливi цитогенетичнi методи

• молекулярно — цитогенетичнi методи (FISH-метод та його рiзновиди)

Стандартнi цитогенетичнi методи.

Для забарвлення хромосоми частiше використовують барвник Романовського — Гiмзи, 2% ацеткармiн, 2% ацетарсеїн. Вони зафарбовують хромосоми повнiстю, рiвномiрно i використовуються для визначення кiлькiсних аюмалiй хромосом людини (45,47 i iнш.). За даними деяких авторiв [1] лише 30% вiд наявної кiлькостi хромосомної патологiї мождиво виявити за допомогою даного методу.

Бiльш сучасним рiзновидом стандартних методiв е диференцiйне забарвлення препаратiв хромосом.

Ще в 1968 роцi Caspersson та iншi дослiдники виявили лiнiйну неоднорiднiсть хромосоми по довжинi — чергування темно — та свiтлозабарвлених смуг (бендiв, вiд англ. “bands”) при диференцiйному забарвленнi хромосоми. З цього моменту стало можливим iдентифiкувати кожну хромосому окремо. Данi методи базуються на специфiчнiй постфiксацiйнiй обробцi готових препаратiв хромосом та вивченнi її структури. Рiвень сегментiв при цьому складає 200 — 400 на гаплоїдний набiр [1]. Методи диференцiйного забарвлення подiляють на Q— метод, G—метод, R — метод. В основi цих методiв лежить застосування спецiальних барвникiв, або попередяя термична обробка препаратiв хромосом, обробка за допомогою розчинiв протеолiтичних ферментiв (трипсин, пепсин) чи солей (2хSSС).

Q— метод (quinacrine, акрихiн ) — дозволяє iдентифiкувати iндивiдуальнi хромосоми , в нашому випадку це – Y – , Х — хромосоми , визначати структурнi аномалiї при проведеннi пре — та постнатальної дiагностики, визначати полiморфiзм в дистальнiй дiлянцi довгого плеча Y — хромосоми. Дiлянки хромосом, якi флуорисцують пiсля забарвлення акрихiн — iпритом або подiбною сполукою.

G — метод (Giemsa, Гiмза ) — використовується при зафарбовуванні барвником Гiмза у поєднанні з додатковими процедурами, якi сприяють тому, щоб барвник адсорбувався найбiльш iнтенсивно на певних дiлянках.

Q— та G — сегменти iдентичнi. У бiльшостi лабораторiй в щоденнiй роботi вiддають перевагу G — методу, оскiльки вiн не потребус використовування флуоресцентного мiкроскопу та забарвленнi препарати можливо зберiгати довгий час. Однак специфiчна перевага Q — методу в тому, що навiть в iнтерфазному ядрi є можливiсть iдентифiкувати Y — хромосому людини за яскравою флуоресценцiєю.

R — метод (геverse, обернений) — забарвлення пiсля контрольованої теплової денатурації. Отримуємо малюнок сегментації хромосом , який протилежний Q— та R — методiв. R- сегмент роэташовується мiж Q— сегментами, або G — сегментами. Використовується в таких же випадках , що i G — метод, а також вiзуалiзує термiнальнi дiлянки хромосоми та R — позитивнi дiлянки, втягнутi в перебудову хромосоми.

С — метод (constitutive heterochromatin, конститутивний гетерохроматин) дозволяе забарвлювати центромерний район в усiх хромосомах та гетерохроматин вторинних навколоцентромерних перетяжок, гетерохроматин коротких плечей акроцентричних хромосом та довгого плеча Y — хромосоми. Також даний метод дозволяє виявляти дицентричні хромосоми, допомагає iдентифiкувати деякi прицентромернi iнверсiї, а також виявляти прицентромерний гетерохроматин в маркерних хромосомах. Оскiльки кожен з методiв має модифiкацiї, номенклатура хромосом передбачае застосування трьохлiтерної системи позначення забарвлення, де перша лiтера позначає основний метод забарвлення, друга — застосований варiант попередньої обробки препарату, а третя лiтера — назву барвника.

Високочутливi цитогенетичнi методи.

Високочутливi цитогенетичнi методи збiльшують частку ідентифікації хромосомних аномалiй до 75% [1]. Хромосоми в профазi та прометафазi конденсованi не стiльки сильно, як метафазнi хромосоми. При обробцi культури лiмфоцитiв метотрексатом (для часткової синхронiзацiї клiтинного циклу) можна накопичити достатньо клiтин , якi знаходяться в профазi та прометафазi. Зменшення часу iнкубацiї з колцемiдом дозволяс уникнути сильної конденсації. В препаратах таких хромосом окремi сегменти, якi виявляються стандартними методами, можна роздiлити на субсегменти. Ступень розрiшення залежить від стадії, на який клiтини були зафiксованi. Деякi автори описують бiльше 2000 сегментiв [6] . Звичайно в пiзнiй стадiї профази можна побачити 800— 1200 сегментiв [1]. Цей метод не замiнює стандартних методiв, проте вiн надзвичайно привабливий при iдентифiкацiї точок розриву та мiлких аберацiй, в цитогенетицi пухлин.

Молекулярно — цитогенетичнi методи (FISH-метод та його рiзновиди).

Флуоресцентна in situ гiбридизацiя — FISH почала з’являтись на початку 90—х рокiв. FISH дала новий етап у дослiдженнi хромосомної патологiї та науковiй дiяльностi. Частка iдентифiкацiї хромосомних аномалiй при цьому методi складає 95 — 99% [1] . Гiбрiдизацiя in situ дозволяє визначити, в якому сегментi знаходиться вiдповiдний маркер. Флуоресцентна in situ гiбридизацiя дозволяс картирувати декiлька рiзних забарвлених маркерiв ДНК, а гiбридизацiя в перiод iнтерфази — визначити порядок маркерiв в окремих дiлянкх хромосоми.

Препарати фiксованих хромосом гiбридизують ( iнкубують при пiдвищеннi температури з послiдуючим охолодженням) з дослiджуваними послiдовностями нуклеотидiв помиченими радiоактивною (³Н та iнш.), флуоресцентною або iншою мiткою (маркер). Після вiдмивання незв’язаної мiтки решта помичених молекул нуклеїнових кислот асоцiйованi з дiлянками хромосом , якi мiстять послiдовностi, комплементарнi дослiджуваним послiдовностям нуклеотидiв. Отриманi гiбриди дослiджуються за допомогою методiв мiкроскопiї (свiтлової, електронної) , або пiсля авторадiографiї. Для цiєї групи методiв характерне бiльш висока розрiшаюча здатнiсть. В результатi великого розвитку даного методу, з’явився новий роздiл цитогенетики — iнтерфазна цитогенетика. Значну роль в розвитку варiантiв FISH дало використання нових методiв мiкроскопiчного зображенкя. Йдеться мова про використання ССD — камер (ССD — камер з високим рiвнем розрiшення, охолоджуваними ССD) — камер з довготривалим часом накопичення сигналу ) з вiдповiдним комп’ютерним забезпеченням. Це дало можливiсть спрощення процес реестрацiї, новi можливостi для подальшого дослiдження.

Використання псевдоколiру.

Крiм реєстрацiї iнтенсивностi сигналу, сучасна технiка дозволяє видiлити його спектральнi характеристики. Йдеться мова про спектральне карiотипування SKY. Наразi зараз достатньо використання чорно — бiлого зображення. Інтенсивнiсть свiтiння кожного флюорохрому записується окремо за допомогою спецiальних фiльтрiв (збуджуючого та запираючого). Для кожного такого зображення дається свiй унiкальний (неповторний) псевдоколiр. Така система, де використовують флюорохроми з неперекриваiючими спектрами емiсiї та збудження, дозволяє використовувати їх в одному експериментi.

Кiлькiсть ДНК проб при використаннi N флiоорохромів можна вирахувати за формулою: 2^N — 1.

24— колiр FISH

Карiотип людини складаеться з 22 аутосом (нестатевих клiтин) та статевих хромосом Х та Y. Тому необхiдно щонайменше 24 унiкальнi ДНК проби. Для мiчення хромосом необхiдно 5 флюорохромив – 2⁵-1=31. Хромосомспецифiчнi ДНК бiблiотеки мiтяться унiкальними комбiнацiями трьох флюорохромiв. В результатi FISH кожнiй хромосомi вiдповiдас свiй псевдоколiр. На рисунку 4 показано FISH з 24 кольорами.

Такий метод хромосомного аналiзу дозволяс виявляти та iдентифiкувати будь — якi транслокацiї матерiалу негомологiчних хромосом.

Якщо хромосома забарвлена бiльш нiж одним кодъором, то це iнформуе про транслокацiю. Колiр хромосомних районiв дає чiтку картину про хромосоми, якi приймали участь в даній хромосомнiй перебудові. Крiм того диференцiйна неоднорiднiсть хромосоми нерiдко дозволяс провести iдентифiкацiю точок з’еднань — розривiв, якi мали мiсце при хромосомнiй перебудовi. Первинний аналiз карiотипу при цiй методицi може бути отриманий менш нiж за двi доби. При цьому результати будуть досить достовiрними. Тiльки для важких випадкiв необхiдно використовувати додатковi дослiдженая. Але для внутрiшньохромосомних змiнах (делецiя, iнверсiя, дуллiкацiя) залишаються невидимими для цього методу.

R_XFISH — метод.

Основа методу полягає в тому ж самому принципi FISH, але на вiдмiну вiд 24— колiрної FISH, дозволяє виявляти частину внутрiшньохромосомних перебудов. Даний метод має три фдюорохрома, отже, можна отримати 7 псевдокольорiв (2³ — 1 = 7). Вони специфiчно забарвлюють окремi райони хромосом. Всi проби забарвлюють декiлька хромосомних районiв рiзних хромосом. Специфiчнiсть ДНК проб пояснюється їхнiм джерелом отримання

– Hylobates concolor та Hylobates syndactylus. В результатi iнтенсивних хромосомних перебудов, яке вiдбувалось при формуваннi сучасних гiбонiв, матерiал їх хромосом виявився сильно перемiшаним у порiвняннi з хромосомами у загального нащадка, а також у людини. Але при внутрiшнiй перебудовi в межах одного кольорового бенду, не може бути використаний. Якщо використовувати бiльшу кiлькiсть флюорохромiв, то даний метод дозволяс бiльш iнформативно вивчати хромосоми лiодини, нiж 24— колiр

FISH.

Даний метод дозволяє автоматизувати процес визначення хромосом людини, iдентифiкувати значну внутрiшньо- та мiжхромосомнi перебудови, для кожної хромосоми iснує свiй окремий баркод, можливо iнтегрування в рiзнi комп’ютернi системи (Cyto Vision i iнш.)

Разом з тим, такi хромосоми як 15,18,19,21 ,22,Х,Y представляють один кольоровий бенд (однокольорове зображення).

М – FISH – метод.

Дана методика використовується для детального аналiзу окремої хромосоми. Для цього було розробленi мiкродисекцiоннi ДНК проби та вiдповiдне програмне забезпечення для порiвняльного аналiзу рiвня свiтiння рiзних флюорохромiв. Районспецефiчнi дiлянки хромосоми помiчаються своїм окремим флюорохромом. В результатi формується цiла мiкродисекцiонна районспецифiчна бiблiотека. Рiвень сигналу кожної з такої бiблiотеки змiнюється вiд максимуму в центрi i поступово спадає до нуля на границi. Варiацiї спiввiдношення iнтенсивностi флюорисценцiй рiзних флюорохромiв вздовж хромосоми забезпечується перекриттям профiлями iнтенсивностi сигналу ДНК проб. В результатi програмнiй обробцi зображення кожному з районiв хромосоми дається свiй псевдоколiр. Дана методика дозволяє iдентифiкувати не тiльки мiжхромосомнi, але й внутрiшньохромосомнi перебудови. Для того, щоб вивчити Х – або Y — хромосоми, їх потрiбно спочатку iдентифiкувати.

Використання Т – променів (ТГц випромінювання) для визначення генетичної статі та аномалій статевих хромосом.

В статті запропоновано визначення генетичної статі та аномалій статевих хромосом за допомогою ТГц випромінювання.

Найважливiшою характеристикою ТГц випромiнювання є абсорбцiя молекулами води. Це може бути використано для визначення рiзницi мiж рiзними тканинами (приклад, мiж м’язовою та жировою).

Терагерцевий імпульс створюється, коли ультракороткий імпульс лазера(приклад, Ti – сапфір лазер),працюючий на довжині хвилі 800 нм та з частотою повторення 80 Мгц, сфокусований на фотопровідниковий фемтосекундний перемикач з арсеніду галію (GaAs), або на так званий терагерцевий емітер. Коли з’являється імпульс ультракороткого лазера, генерується фотострум на перемикачі; швидкоплинний струм, який проходить через емітер створює умови для короткотривалого вибуху терагерцевого випромінювання. Система дзеркал фокусують терагерцеве випромінювання на досліджуваному зразку. Визначення Т – променів забезпечується шляхом використання оптичного напівпровідникового перемикача, схожий на випромінювач. Фемтосекундні інфрачервоні імпульси ближнього діапазону вмикають оптичний перемикач. Час затримки між терагерцевими та оптичними імпульсами змінюється, щоб виміряти наявність терагерцевого поля. Забезпечивши дані вимірювання перетворенням Фур’є, за рахунок аналізу хвиль, отримуємо частотну інформацію про досліджувальний об’єкт.

На рис.3 наведена схема запропонованого приладу.

ТГц – лазером 1 генерується високочастотне випромінювання, яке проходить через дохронне дзеркало А і розщеплюється на два пучки (I та II). Перший пучок йде через систему дзеркал А, З, Г, Д, Є, Ж та потрапляє безпосередньо на ТГц – фотодетектор 3 . Другий пучок випромінювання, проходячи через систему дзеркал А, Б, В, потрапляє на фемтосекундний перемикач 2 , далі, проходячи через об’єкт дослідження, потрапляє, також, на ТГц – фотодетектор.

Крім того, для даного приладу, передбачено встановлення всіх необхідних компонент (спеціальне дихронне дзеркало, фільтр збудження, запираючий фільтр) для FISH – діагностики. Це передбачає підвищення чіткості та якості зображення, деталізації об’єктів, визначення досить дрібних аномалій хромосом, ідентифікацію кожного сегменту хромосоми.

Висновок

В даній роботі запропоновано новий метод визначення генетичної статі індивідуума за даними цитологічного дослідження за допомогою Т – променів.